Клинико-лабораторные подходы к дифференциальной диагностике сахарного диабета 1 и 2 типов

В настоящее время общепризнанным являются представления о существовании двух основных типов сахарного диабета: первого типа (СД-1) и второго типа (СД-2). Рядом авторов[2, 8] сформулирована достаточно стройная концепция патогенеза СД-1, согласно которой сочетание наследственной  предрасположенности и неблагоприятных факторов внешней среды приводит к иммунной аутоагрессии против β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы и развитию в конечном итоге абсолютной инсулиновой недостаточности (СД-1). Представления о патогенезе СД-2 менее определенны. Большинство авторов [1, 6, 8, 10] признают основной причиной его возникновения наличие дефектов в системе инсулинорецепторных взаимодействий и на основе этого формирование тканевой инсулинорезистентности, обусловливающей возникновение метаболических нарушений при нормальном или даже повышенном уровне эндогенного инсулина.

Определение типа сахарного диабета в клинической практике имеет принципиальное значение, так как позволяет решить вопрос о выборе лечебной тактики. Однако далеко не во всех случаях удаётся отнести диабет к первому или второму типу. Определение концентрации иммунореактивного инсулина (ИРИ) и С-пептида в плазме крови также не всегда дает возможность решить диагностическую задачу, потому что при СД-1 в ряде случаев сохраняется остаточнаяфункция β-клеток [1, 2], а при СД-2 нередко выявляется поражение островкового аппаратаподжелудочной железы с развитием абсолютной инсулиновой недостаточности [1].

Эти обстоятельства требуют поиска новых лабораторных тестов, позволяющих определять тип сахарного диабета. Руководствуясь предположением о возможных различиях метаболизма в тканях больных СД-1 и СД-2 [9, 10], а также сведениями о разных уровнях активности перекисного окисления липидов (ПОЛ) при этих типах сахарного диабета [3, 8], сделана попытка оценки диагностической значимости определения ряда показателей метаболизма в эритроцитах и характера их изменений под влиянием активаторов ПОЛ.

Цель исследования:

Изучить влияние уровня ПОЛ на активность ключевых ферментов гликолиза и пентозного цикла, содержание циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) в эритроцитах больных сахарным диабетом 1 и 2 типов.

Материалы и методы:

Материалом для исследования служили отмытые эритроциты периферической венозной крови 76 больных сахарным диабетом средней тяжести и 17 здоровых доноров, взятой утром натощак. У 24 больных (15 мужчин и 9 женщин) был СД-1, у 52 (38 мужчин и 14 женщин) - СД-2. Тип сахарного диабета определяли на основании комплекса клинических критериев, а также показателей иммунореактивного инсулина (ИРИ) и С-пептида в плазме крови, определенных радиоиммунологическим методом с использованием коммерческих наборов реактивов фирм «International-CIS» (Франция), «DRG  International» (США) на приборе «Clinic Gamma 1272 LKB».

С целью получения достоверных результатов кровь для исследования брали у больных с отчетливыми клиническими проявлениями, определяющими тип сахарного диабета. Кровь отбирали из локтевой вены перед завтраком с 9 ч 00 мин до 10 ч 30 мин.

Средний возраст больных СД-1 составил 36±2 года, длительность заболевания колебалась от 10 до 15 лет. В анамнезе у большинства больных отмечались эпизоды ацетонурии. Все больные получали заместительную терапию препаратами инсулина в дозе от 24 до 92 ЕД в сутки. У 9 больных было лабильное течение диабета. Средний возраст больных СД-2 составил 55±2 года, длительность заболевания варьировала от 3 до 9 лет. У больных СД-2 никогда не отмечалось ацетонурии. 39 больным СД-2 проводили лечение препаратами сульфонилмочевины; 13 больных после предшествующего длительного периода лечения противодиабетическими препаратами в таблетках получали от 40 до 140 ЕД инсулина в сутки. У 28 больных была нормальная и у 24 - избыточная масса тела.

В контрольной группе (доноры) было 9 мужчин и 8 женщин с нормальной массой тела; их средний возраст составил 35 лет.

Содержание глюкозы в сыворотке крови, инсулинсодержащих эритроцитов (ИСЭ) и некоторых показателей метаболизма в эритроцитах определяли в базальных условиях и после добавления двухвалентного железа, аскорбата и витамина D2 с целью стимуляции процессов ПОЛ мембран эритроцитов по методике, описанной В.Ю. Куликовым и соавт. [4]. Определяли следующие показатели метаболизма глюкозы и его регуляции в эритроцитах: активность ключевых ферментов гликолиза и пентозного цикла - фосфофруктокиназы (ФФК) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ)

[5], содержание цАМФ и цГМФ. Кроме того, с учетом современных представлений о роли ПОЛ в модификации клеточных мембран, оценивали степень перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ), уровень накопления в них диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА), а также состояние внутриклеточной антиоксидантной системы по уровню восстановленного глутатиона (ВГ).

Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета программ ЕХCЕL-95 иStatistica 7.1., достоверность между полученными показателями в сравниваемых подгруппах оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона - Манна - Уитни.

Результаты и их обсуждение:

Результаты обследования представлены в таблице. Как видно из представленных данных, у больных при первом и втором типах диабета в эритроцитах существуют два варианта утилизации глюкозы, принципиально различных между собой. Установлено, что исходный уровень пероксидации у больных СД-1 существенно выше, а у больных СД-2 имеет тенденцию к снижению по сравнению с контрольной группой.

Показатели метаболизма глюкозы, ПОЛ и антиоксидантной системы эритроцитов у больных СД-1 и СД-2 под влиянием активации ПОЛ

Показатель

Здоровые; n=17

Больные СД-1; n=24

Больные СД-2; n=52

I

II

I

II

I

II

Глюкоза, ммоль/л

4,4±0,4

3,9±0,6

10,5±0,6

9,6±1,3

9,8±0,7

4,8±0,2

Инсулиносодержащие эритроциты, %

628±37

631±24

602±24

560±38

557±29

634±34

Перекисный гемолиз эритроцитов,

ед. опт. пл.

0,032±

0,009

0,072±

0,010**

0,065±

0,011*

0,134±

0,013**

 0,030±

0,005

0,054±

0,011

Диеновые

коньюгаты, ммоль/л

5,52±1,67

9,24±1,20**

13,90±1,10*

26,80±1,70**

4,29±1,10

11,40±1,30**

Малоновый диальдегид, кмоль/л

5,15±0,29

9,65±0,37**

7,59±0,58*

11,40±1,19**

6,53±0,58

10,21±0,47**

Восстановленный глутатион, МЕ/109 эр.

98,3±2,6

96,9±3,1

107,7±2,3*

78,9±2,4**

82,4±6,5

101,3±5,7**

цАМФ, пмоль/109эр.

0,65±0,13

0,92±0,50

0,93±0,10

1,13±0,17

 1,23±0,19

0,96±0,09

цГМФ, пмоль/109эр.

0,25±0,02

0,28±0,03

0,12±0,02*

0,26±0,04**

  0,28±0,02

0,41±0,05**

ФФК, МЕ/109 эр.

0,26±0,01

0,23±0,02

0,17±0,02*

0,13±0,02

 0,13±0,01*

0,19±0,01**

Г-6-ФДГ, МЕ/109 эр.

296,0±14,4

248,4±12,7

287,5±13,4

113,4±18,7*

141,0±32,4*

294,8±23,1**

ИРИ, мкЕД/мл

9,8±1,8

9,1±1,1

6,3±0,23

6,2±0,25

9,8±1,7

9,7±1,8

С-пептид, мкг/л

1,4±0,37

1,48±0,35

0,8±0,28

0,7±0,31

1,68±0,18

1,57±0,17

 

Примечание. I - показатель в базальных условиях, II - после добавления к сыворотке крови аскорбата и витамина D2; * - статистически достоверные различия исходных показателей по сравнению с контролем (p1<0,05), 
** - различия по сравнению с исходными (базальными) значениями (p2<0,05); эр. - эритроциты.

Базальный уровень цАМФ в эритроцитах больных с первым и вторым типами сахарного диабета был выше нормы в 1,2-1,5 раза, а содержание цГМФ в эритроцитах больных СД-1 было почти в 2 раза ниже, чем в контроле. Активность ФФК в эритроцитах у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов оказалась ниже, чем у здоровых в 1,8-2 раза, особенно при СД-2. В то же время активность Г-6-ФДГ эритроцитов у больных СД-1 не отличалась от таковой в норме, а у больных СД-2 была ниже, чем в контрольной группе почти в 2 раза. При СД-2 индукция ПОЛ в эритроцитах больных наряду с повышением содержания перекисных продуктов - МДА и ДК, сопровождалась изменением показателей метаболизма глюкозы. При этом исходно высокий уровень ВГ в эритроцитах больных СД-1 отчетливо понижался (на 27,6%), а у больных СД-2 имел тенденцию к повышению (на 22,5%). Содержание цАМФ существенно не изменялось, а концентрация цГМФ значительно повышалась как при СД-1, так и при СД-2, причем, в последнем случае его уровень превысил значения в контроле в 1,12 раз.

Наибольший интерес представляют данные по активности ключевых ферментов гликолиза и пентозного цикла у больных с 1 и 2 типами сахарного диабета. Установлены разнонаправленные изменения. У больных СД-2 активность Г-6-ФДГ и ФФК эритроцитов значительно повысилась (Г-6-ФДГ на 109,1%, ФФК на 46,1%), а у больных СД-1 была ниже контрольных показателей. Максимально выраженная при СД-2 динамика активности Г-6-ФДГ сопровождалась увеличением содержания ИСЭ на 13,8% и понижением концентрации глюкозы в реакционной среде.

Таким образом, полученные результаты позволили предложить диагностический тест определения типа сахарного диабета по направленности изменения активности Г-6-ФДГ эритроцитов при активации процессов ПОЛ.

Методика проведения предлагаемого диагностического лабораторного теста достаточно проста в проведении и заключается в следующем. Из крови больного, взятой из пальца в объеме 0,2 мм, стабилизированной 5% раствором ЭДТА в соотношении 9:1, отмывают эритроцитную взвесь физиологическим раствором общепринятым методом [7]. Отмытую эритроцитную взвесь обрабатывают двухвалентным железом, аскорбатом и витамином D по указанному методу. В 0,05 мл отмытой эритроцитной взвеси до и после инициации ПОЛ определяют активность Г-6-ФДГ [5]. В качестве контроля берут 0,2 мл крови здорового донора и обрабатывают параллельно с опытной пробой.

Использование данного диагностического теста может позволить в сомнительных случаях определять тип сахарного диабета. Так, усиление активности Г-6-ФДГ под влиянием активаторов ПОЛ на 15% и более характерно для СД-2, а снижение более чем на 15% - для СД-1. У здоровых активность фермента изменяется, как правило, не более чем на 10%.

Выводы:

1. У больных СД-1 и СД-2 имеются различия в показателях ПОЛ, активности ключевых ферментов гликолиза, пентозного цикла и содержании цГМФ в эритроцитах периферической крови.

2. Инициация процессов ПОЛ в эритроцитах сопровождается отчетливым снижением активности Г-6-ФДГ и ФФК при СД-1 и достоверным повышением активности ферментов углеводного обмена при СД-2.

3.  Определение  активности Г-6-ФДГ и ФФК в эритроцитах до и после инициации процессов ПОЛ может быть использовано в качестве, дифференциально-диагностического теста при определении типа сахарного диабета.

Литература:

1. Алишева, Е.К. Методы диагностики инсулинорезистентности / Е.К. Алишева, Е.И. Красильникова, Е.В. Шляхто // Артериальная гипертензия. - 2002. - № 1. - С. 29-34.

2. Выдрыч, А.Н. Состояние некоторых звеньев эндокринной системы у мужчин с диабетической нефропатией / А.Н. Выдрыч, С.Б. Шустов // Вестн. Рос. Воен. мед. акад. - 2008. - № 1 (21). - С. 12-15.

3. Данилишина, В.С. / В.С. Данилишина, В.Л. Кушнир // Тер. арх. - 1984. - № 10. - С. 86-88.

4. Куликов, В.Ю. / В.Ю. Куликов, Л.И. Колесникова, Л.В. Молчанова // Вопр. мед. химии. - 1976. -Т. 22, № 5. - С. 617-620.

5. Методы биохимических исследований / под ред. М.И. Прохоровой // - Л., 1982. - 272 с.

6. Перова, Н.В. Метаболический синдром: патогенетические взаимосвязи и направления коррекции / Н.В. Перова, В.А. Метельская, Р.Г. Оганов // Кардиология. - 2001. - № 3. - С. 27 - 32.

7. Покровский, А.А. Биохимические методы исследования в клинике / А.А. Покровский. - М.: 1969. - 85 с.

8. Творогова, М.Г. Инсулинорезистентность и методы её диагностики / М.Г. Творогова, К.Н. Яськова, И.Е. Чазова // Лабораторная медицина - 2003 - № 6. - С. 48 - 52.

9. Lohr, E.W. Methoden der enzymatischen Analyse. / E.W. Lohr, H.D. Waller, H.U. Bergmeyer //Weinheim - 1974. - Bd 1. - P. 673.

10. Reaven, G.M. Introduction. The role of insulin  resistance in the pathogenesis and treatment of noninsulin - dependent diabetes mellitus. / G.M.  Reaven //Amer. J. Med. - 1983. - Vol. 74. - P. 1-2.