Диагностическая значимость определения циклических нуклеотидов в лейкоцитах больных сахарным диабетом 1 и 2 типов

Циклический 3΄, 5΄-аденозинмонофосфат (цАМФ) и циклический 3΄, 5΄-гуанозинмонофосфат (цГМФ) относятся к универсальным регуляторам метаболических процессов в живых клетках. Концентрация циклические нуклеотиды (ЦН) в клетке поддерживается путем регуляции соотношения активностей ферментов - циклаз (аденилатциклазы и гуанилатциклазы) и гидролизующих ЦН фосфодиэстераз. Концентрация цАМФ и цГМФ в клетках очень мала и измеряется пикомолями. Характерно, что многие биохимические эффекты цАМФ прямо противоположны эффектам цГМФ. Антагонистические отношения ЦН появляются чаще всего в сложных системах, когда для регуляции внутриклеточных процессов требуется разновременная модификация многих белков, осуществляемая согласованным действием попеременно активируемых цАМФ- и цГМФ-зависимых протеинкиназ [3, 6].

Повышенное содержание цАМФ в клетках приводит к фосфорилированию клеточных мембран и увеличению в цитоплазме концентрации Са2+, активизирующего фосфодиэтеразу. В результате этого  ускоряется гидролиз цАМФ и синтез цГМФ. Образование цАМФ ускоряется адреналином, а цГМФ - ацетилхолином, поэтому принято считать, что цАМФ стимулирует в основном процессы распада (катаболизма), а цГМФ - процессы синтеза (анаболизма). Следует отметить, что сродство ЦН к цАМФ- и цГМФ-зависимых протеинкиназ в 100-1000 раз больше, чем у фосфодиэстераз. Этим объясняется метаболический механизм контроля за максимальной степенью повышения концентрации ЦН в клетках [3, 6-8].

В этой связи представляется перспективным проведение исследования по изучению биохимических механизмов, выявление общих процессов при сравнении показателей внутриклеточного метаболизма и гормональной регуляции у больных сахарным диабетом (СД). 

Цель исследования:

Изучить диагностическую значимость содержания цАМФ, цГМФ и соотношения цАМФ/цГМФ в лейкоцитах больных СД в ходе проведения инсулинотолерантного теста (ИТТ) и оценить роль ЦН в развитии тканевой инсулинорезистентности.

Материалы и методы:

Обследовано 52 пациента с СД. Тип СД определялся на основанииклинических критериев, предложенных комитетом экспертов ВОЗ [1, 2]. Больных с СД1 было 29 (19 мужчин и 10 женщин), их средний возраст составил 30,6 лет (17-46 лет), они имели нормальную массу тела, длительность заболевания варьировала от 10 до 24 лет. Больных с СД2было 23 (20 мужчин и 3 женщин), их средний возраст составил 54,7 лет (20-67 лет), 9 из них имели алиментарно-конституциональное ожирение I-II степени, длительность заболевания варьировала от 10 до 18 лет. Группу контроля составили 19 здоровых мужчин, находящихся в клинике на диспансерном обследовании, средний возраст которых составил 48,8 лет (31-59 лет). Обследование проводилось через 1 неделю пребывания больных и лиц контрольной группы в условиях стационара. За 2 суток до обследования все препараты, за исключением инсулина, нитратов и гипотензивных средств, отменялись.

Обследуемым больным утром натощак до введения лечебной дозы инсулина и получения таблетированных препаратов проводилось внутривенное капельное введение простого монопикового инсулина в 200 мл физиологического раствора в дозе: больным СД 0,2 ед/кг, а лицам контрольной группы - 0,1 ед/кг в течение 90 мин. Взятие крови для исследования производилось до и сразу после ИТТ. После взятия последнего образца крови с целью профилактики гипогликемии больным внутривенно вводилось 20 мл 40% раствора глюкозы, после чего больные завтракали. Перед завтраком больным с СД1 вводилась обычная утренняя доза инсулина за вычетом количества инсулина, введенного при ИТТ. В ходе пробы через каждые30 мин определялась концентрация глюкозы в крови, производился контроль артериальногодавления, электрокардиографическое исследование. При достижении уровня глюкозы в крови 3,5 ммоль/л или появлении субъективных клинических признаков легкой гипогликемии, проба прекращалась. Переносимость ИТТ больными была хорошая.

Концентрация глюкозы и количества инсулинсодержащих эритроцитов (ИСЭ) в крови определялась общепринятым методом. Взятие крови для определения содержания лейкоцитарных ЦН, концентрации иммунореактивного инсулина (ИРИ) и С-пептида в плазме производилось с помощью вакуумных систем Vacuette «Greiner» с ЭДТА. Концентрацию цАМФ, цГМФ и гормонов определяли радиоиммунологическим методом на приборе «Clinic Gamma 1272 LKB». После выделения лейкоцитарной взвеси производился подсчет лейкоцитов на гематологическом анализаторе «Coulter LH500» фирмы «Beckman Coulter» (США), после чего клетки разрушались, а взвесь замораживалась при температуре 20ОС для последующего определения концентрации нуклеотидов радиоиммунологическим методом. Расчет содержания нуклеотидов производился на 109 клеток. Для определения концентрации ИРИ, С-пептида, цАМФ и цГМФ использовались коммерческие наборы реактивов фирм «Amersham», «Biodata», «Internationale-CIS», «BehrindwerkeAG» (Австрия).

Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета прикладных программ ЕХCЕL-95 и Statistica 7.1, достоверность между полученными показателями в сравниваемых подгруппах оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона - Манна - Уитни.

Результаты и их обсуждение:

Результаты клинико-лабораторных исследований больных СД при проведении ИТТ приведены в таблице.

Динамика лабораторных показателей у больных СД при проведении инсулинотолерантного теста

Показатель

Группы обследуемых

Здоровые, n=19

СД1, n=29

СД2, n=23

I

II

I

II

I

II

Глюкоза, ммоль/л

4,9±0,1

3,3±0,2*

10,9±0,6**

7,6±0,6*

8,6±0,5**

6,7±0,6*

ИСЭ, ед.

628±37

610±20

602±24

629±32

557±29**

562±24

ИРИ, мкЕд/мл

12,1±1,5

19,0±1,6*

15,5±1,8

29,3±4,5*

19,8±2,2**

175,9±14,7*

С-пептид, нг/мл

1,9±0,2

1,3±0,2

0,7±0,1

0,6±0,1

1,3±0,2

0,9±0,1*

 цАМФ, пмоль/109лейк.

0,7±0,1

1,6±0,2*

0,8±0,1

1,2±0,2*

1,4±0,2**

0,7±0,1*

цГМФ, пмоль/109лейк.

0,4±0,1

0,3±0,1

0,3±0,1

0,3±0,1

0,3±0,1

0,5±0,1

цАМФ/цГМФ, ед.

1,57

6,12

2,43

4,45

4,89

1,40

 

Примечание: I - исходные показатели; II - после ИТТ; * - при сравнении с исходными показателями после ИТТ в группе, р<0,05; ** - при сравнении с исходными показателями здоровых людей, р<0,05.

Степени снижения концентрации глюкозы в обеих группах больных СД существенно неотличались. Концентрация С-пептида закономерно снижалась у всех обследуемых под влияниеминфузии инсулина, что, возможно,  свидетельствует о снижении инкреторной функции b-клеток. Лишь у больных СД1 с исходно низкой остаточной функцией b-клеток концентрация С-пептидапрактически не менялась. Исходный уровень ИРИ в группе больных СД1 является интегральнымпоказателем, зависящим как от секреции эндогенного инсулина, так и от концентрацииэкзогенного инсулина, поступающего в кровь в процессе лечения.

Принято считать, что как уровень ИРИ, так и содержание в крови С-пептида отражают функциональную активность b-клеточного аппарата поджелудочной железы [4, 9, 10]. Между тем у больных СД2 концентрация ИРИ в крови была достоверно выше, а С-пептида - ниже на 32% контрольных значений. Выявленное противоречие может быть объяснено известным фактом снижения активности печеночной инсулиназы у больных СД2 [7, 9]. Нельзя исключить также возможность повышения концентрации циркулирующего инсулина вследствие снижения егоутилизации тканями в результате характерной для этой категории больных тканевой инсулинорезистентности [1, 5, 8]. Увеличение концентрации ИРИ после ИТТ происходило, по-видимому, за счет внутривенного введения простого инсулина. Если у здоровых людей и больных СД1 концентрация ИРИ увеличивалась в 1,5-2 раза, то у больных СД2 - в 8-10 раз, что является свидетельством тканевой инсулинорезистентности, которая считается основным патобиохимическим фактором в нарушениях углеводного обмена у данной категории больных [1, 5, 8].

Исходное содержание цАМФ в лейкоцитах больных СД1 имело лишь тенденцию кповышению, а у больных СД2 уровень цАМФ был выше нормы в 2 раза при сравнении с контролем.

ИТТ вызывал достоверное повышение цАМФ в лейкоцитах здоровых, больных СД1, а у пациентов, страдающих СД2, направленность реакции была противоположной - уровень цАМФ снизился по сравнению с базальным, достигая значений нормы. Содержание лейкоцитарного цГМФу больных, страдающих СД 1 и 2 типов, было несколько ниже нормы. Под влиянием ИТТ уровень цГМФ у здоровых, больных СД1 имел тенденцию к снижению, а у больных СД2 он повышался по сравнению с исходными значениями. Метаболистическая ситуация в клетке в значительной степени определяется соотношением содержащихся в ней цАМФ и цГМФ. Коэффициент цАМФ/цГМФ у больных СД2 до ИТТ был значительно выше, чем в других группах обследуемых. ИТТобуславливал неодинаковую направленность изменения этого коэффициента: у здоровых,больных СД1 он повышался, а у больных СД2 - снижался по сравнению с исходными значениями. Количество ИСЭ в ходе инсулиновой нагрузки достоверно не изменялось ни в одной группе обследуемых, однако необходимо отметить достоверно низкий исходный уровень ИСЭ у больных СД2 по отношению к исходному уровню здоровых.

Новизна проведенного исследования определялась использованием нового методического приема, заключающегося в динамической оценке показателей внутриклеточного метаболизма, состоянии клеточных мембран и нейрогормональной регуляции под влиянием одного из основных физиологических регуляторов метаболизма - инсулина. Использование этого приема позволило выявить различия в обмене ЦН у больных СД 1 и 2 типов, предложить новый диагностический маркер для оценки степени тканевой инсулинорезистентности. Кроме того, на основании фактов, полученных в ходе исследования, удалось предложить дифференциально-диагностический тест, позволяющий в сложных случаях определить тип СД по динамике содержания лейкоцитарных ЦН в ходе ИТТ.

Выводы:

1. У больных СД1 и здоровых лиц соотношение содержания цАМФ и цГМФ лейкоцитов периферической крови под влиянием ИТТ повышается, а у больных СД2 исходно повышенный по сравнению с нормой коэффициент цАМФ/цГМФ, напротив, снижается в основном за счет разнонаправленных изменений содержания цАМФ.  

2. Более высокая степень нарастания концентрации ИРИ в ходе ИТТ у больных СД2 по сравнению с больными СД1 и здоровыми лицами, сочетающаяся с извращенной реакцией лейкоцитарных ЦН в основном за счет содержания цАМФ, свидетельствует о ведущей ролиособенностей внутриклеточного обмена в формировании тканевой инсулинорезистентности у этой категории больных.

3. Степень нарастания инсулинемии и выраженное уменьшение коэффициента цАМФ/цГМФ в ходе ИТТ могут служить признаками тканевой инсулинорезистентности.

Литература:

1. Алишева, Е.К. Методы диагностики инсулинорезистентности / Е.К. Алишева, Е.И. Красильникова, Е.В. Шляхто // Артериальная гипертензия. - 2002. - № 1. - С. 29-34.

2. Балаболкин, М.И. Новая классификация, критерии диагностики и компенсации сахарного диабета / М.И. Балаболкин, Е.М. Клебанова, В.М. Креминская // Эндокринология. - 2000. - Т. 2, № 5. - С. 33-36.

3. Васильев, В.Ю. Циклический аденозинмонофосфат - биологическая роль и механизм действия / В.Ю. Васильев, Н.Н. Гуляев, Е.С. Северин // Журн. Всесоюзн. хим. общ-ва им. Д.И. Менделеева. - 1995. - № 3 (20). - С. 41-45.

4. Выдрыч, А.Н. Состояние некоторых звеньев эндокринной системы у мужчин с диабетической нефропатией / А.Н. Выдрыч, С.Б. Шустов // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2008. - № 1 (21). - С. 12-15.

5. Пастушенков, В.Л. Влияние инициации процессов перекисного окисления липидов на клинико-лабораторные показатели внутриклеточного метаболизма глюкозы у больных сахарным диабетом / В.Л. Пастушенков, А.Н. Дрыгин, С.Б. Шустов // Мед.-биол. и соц.-психол. пробл. безопасности в чрезв. ситуациях. - 2010. - № 1. - С. 67-71.

6. Федоров, Н.А. Циклический гуанозинмонофосфат: метаболизм и его биологическая роль / Н.А. Федоров // Успехи современной биологии. - 1996. - № 4 (82). - С. 96-98.

7. Филимонова, Т.Н. Циклические нуклеотиды полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови при хронических заболеваниях печени : автореф. дис. … канд-та мед. наук / Т.Н. Филимонова. - Ставрополь. : СГМедА, 1998. - 20 с.

8. Шустов, С.Б. Клинико-лабораторные подходы к дифференциальной диагностике сахарного диабета 1 и 2 типов / С.Б. Шустов, А.Н. Дрыгин, В.Л. Пастушенков // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2010. - № 1(29). - С. 86-89.

9. Evans, J.L. Oxidative stress-activated are signaling pathways mediators of insulin resistance and b-cell dysfunction / J.L. Evans [et al.] // Diabetes. - 2003. - Vol. 52. - P. 1-8. 

10. Kaneto, H. Role of reactive oxygen species in the progression of type 2 diabetes and atherosclerosis / H. Kaneto, Y. Nakatani, T. Miyatsuka // Endocrine Journal. - 2008. - Vol. 55, № 4. - Р. 235-252.